De Jenner a la criomicroscopía electrónica: 200 años de historia y la estructura del virus de su vacuna

Carlos Rojas

Centro de Microscopía Electrónica «Dr. Mitsuo Ogura»

Facultad de Ciencias

La viruela humana —del latín variola, “pústula pequeña”— es una enfermedad viral felizmente erradicada en la actualidad, pero que hasta bien entrado el siglo XX causó estragos en la humanidad. Se trataba de una dolencia muy contagiosa cuyos síntomas se manifestaban durante aproximadamente un mes: comenzaba con escalofríos, fiebre muy alta, dolores musculares, articulares y de cabeza, náuseas y vómitos; siendo el síntoma definitivo la aparición de numerosas pústulas en la piel, llenas de un fluido espeso, que reventaban dolorosamente y luego se secaban formando costras, dejando cicatrices muy visibles. Su tasa de mortalidad era muy alta (~30 %), especialmente entre los niños, pero los sobrevivientes quedaban inmunes a nuevas recaídas.

Durante muchos siglos, la viruela azotó a las poblaciones de África, Europa y Asia, afectando tanto a las clases populares como a las dirigentes. Se cree que la padecieron algunos faraones del antiguo Egipto, y se sabe que la sufrió la reina Isabel I de Inglaterra (s. XVI) y que el rey Luis XV de Francia (s. XVIII) murió a causa de esta enfermedad. La conquista de América (s. XVI) expuso a las poblaciones indígenas, sin inmunidad previa —pues no habían estado expuestas a este patógeno del Viejo Mundo—, haciéndolas extremadamente vulnerables a la infección ①. Esto causó una verdadera catástrofe demográfica que facilitó la conquista española, especialmente en Perú y México.

Edward Jenner y la vacuna

En Asia y luego en Europa, de donde pasó a América, se había venido practicando la “variolización”: la búsqueda de inmunidad mediante la inoculación en personas sanas de material proveniente de enfermos que padecían una forma menos severa de viruela. Aunque era un procedimiento arriesgado, logró reducir la tasa de mortalidad. Sin embargo, las posibilidades de control de la viruela y de su eventual erradicación cambiaron drásticamente gracias al descubrimiento que en 1796, en Inglaterra, hizo el médico y naturalista Edward Jenner (1749-1823) ②.

Jenner había practicado la variolización y sabía que existía una variedad de viruela (vaccinia o viruela vacuna) que afectaba a los bovinos. En las ubres de las vacas aparecían
pústulas similares a las de la viruela humana, y el contacto con ellas a través de pequeñas cortaduras podía transmitir la enfermedad a las personas, aunque de forma leve. Jenner
observó que las ordeñadoras de vacas afectadas por esta viruela vacuna no se contagiaban de la viruela humana.

Conjeturó entonces que esa forma benigna podría ser usada para inmunizar a la gente contra la temida forma maligna.

Basado en esta hipótesis, procedió a inocular el fluido de una pústula de una ordeñadora a un niño sano de ocho años, con la esperanza de que éste adquiriera inmunidad a la viruela. Así fue: el niño desarrolló la viruela vacuna de forma leve y se recuperó a los pocos días. Dos meses después, Jenner inoculó material de una pústula proveniente de
un enfermo con viruela humana y demostró que el niño no contrajo la enfermedad. ¡La inmunización se había logrado!

En 1798 Jenner publicó su descubrimiento bajo el título An inquiry into the causes and effects of the variolae vaccinae ③, con el que se acuña el término vacuna, derivado del latín vacca (vaca). En Francia la propuesta de Jenner fue rápidamente aceptada, y en
1801 se publicó una especie de manual para la correcta aplicación de la vacuna, titulado Traité historique et pratique de la vaccine ④, del médico Jacques-Louis Moreau de la Sarthe (1771-1826).

Posteriormente, en 1881, en reconocimiento al aporte de Jenner, el afamado microbiólogo francés Luis Pasteur recomendó el uso del término “vacuna” para todas las inmunizaciones, tal como lo utilizamos hoy en día.

Francisco Xavier de Balmis y la campaña de inmunización

Una vez descubierto el método de inmunización contra la viruela, el verdadero impacto de este hallazgo residiría en su difusión y uso masivo. La vacuna de Jenner comenzó a utilizarse rápidamente en Europa, llegando a España en 1800, bajo el reinado de Carlos IV. El rey estaba bien informado de los estragos que la viruela venía causando en la población de sus dominios de ultramar, con frecuentes brotes epidémicos, y tal vez también se hallaba sensibilizado personalmente por la muerte de una de sus
hijas de tres años a causa de esta enfermedad. Su cirujano de cámara, Francisco Xavier de Balmis (1753-1819), era un entusiasta partidario de la vacunación, ya que había presenciado en México los terribles efectos de la epidemia de viruela de 1779.

El rey Carlos mandó entonces organizar y financiar la “Real Expedición Filantrópica de la Vacuna” (1803-1806), bajo la dirección de Balmis, la primera campaña de inmunización
generalizada, que abarcó los dominios españoles en América y Filipinas, llegando también a territorio chino. Los objetivos de la Expedición fueron “difundir la vacuna desde el Reino de España a todos los virreinatos ultramarinos, instruir a los sanitarios locales
de las poblaciones visitadas para dar continuidad a la práctica de la vacunación a lo largo del tiempo, y crear en los virreinatos Juntas de Vacunación como centros para conservar, producir y abastecer de vacunas activas para mantener la campaña de forma
permanente”.

En la época no se contaba con métodos de preservación duradera para la sustancia a inocular, por lo que para el viaje transoceánico Balmis ideó transportarla in vivo usando niños inoculados, a los que les iba pasando el fluido de “brazo a brazo” mediante punciones con lanceta. Además, Balmis había traducido el tratado de Moreau de la Sarthe y portaba 500 ejemplares de dicha traducción para dejárselas a las diferentes Juntas de Vacunación.

La expedición partió de La Coruña con 22 niños y tras una escala en Las Canarias llegó a Puerto Rico, donde no fue bien recibida pues se argumentó que no era necesaria en esa isla. Continuó hacia Venezuela, llegando a Puerto Cabello en 1804, donde comenzó la vacunación, para seguir por tierra a Caracas, donde fue recibida con entusiasmo. Allí se creó la primera Junta de Vacunación del continente. Notables personajes del inicio de
nuestra gesta independentista, como Vicente Salias y Andrés Bello, llegaron a formar parte de la Junta; habiendo compuesto en ese entonces el joven poeta Bello una “Oda a la Vacuna”. Desde Venezuela, la expedición se bifurcó: una rama pasó a Cuba, México y Filipinas, y la otra recorrió el resto de Sudamérica ⑤, finalizando en 1806 tras haber inmunizado a más de 500.000 personas; toda una proeza sanitaria para la época. Jenner calificó esta empresa como un hito histórico sin precedentes, afirmando que no podía imaginar en los anales de la historia un ejemplo de filantropía tan noble y amplio como la expedición española.

200 años del Epítome de la Vacuna de José María Vargas

Dos años después de concluida la Real Expedición, en 1808, el rey Carlos cedió el poder a Napoleón Bonaparte, iniciándose primero en España y luego en sus posesiones americanas una tumultuosa época de unos quince años de guerra, que indudablemente afectó la continuidad del trabajo iniciado por las Juntas de Vacunación.

Una vez terminado el conflicto armado, las nuevas naciones de Hispanoamérica retomaron su preocupación por las condiciones sanitarias de la población.

En Venezuela se destaca la labor del Dr. José María Vargas (1786-1854) ⑥, quien hace justo 200 años, en 1826, publicó su Epítome sobre la Vacuna ⑦, impreso en Caracas, considerado nuestro primer libro de medicina. En su obra, Vargas narra la historia que
ya conocemos del origen de la vacuna, para luego tratar aspectos prácticos, tales como la variedad de los síntomas, los detalles de cómo efectuar la vacunación, los métodos para tratar a los vacunados y las formas de propagar y conducir el virus vacuno de un lugar a otro. En su Epítome, Vargas plantea “la esperanza de hacer desaparecer algún día de entre los hombres, un mal tan atroz”.

En Venezuela la viruela desapareció desde 1957. Finalmente, la humanidad toda vio materializada la esperanza de Vargas al reportarse el último caso de viruela, ocurrido en Somalia en 1977. Tras un moderno plan concertado de erradicación iniciado en 1967 —que en muchos aspectos recuerda a la Real Expedición Filantrópica de la Vacuna—, la Organización Mundial de la Salud, gracias al uso intensivo de la vacuna de Jenner,
declaró oficialmente erradicada la viruela en todo el mundo.

En biomedicina es fundamental el conocimiento de la relación estructura-función, ya que la disposición física (estructura) determina la actividad biológica (función) a nivel molecular, celular y tisular. Comprender esta relación es esencial para identificar mecanismos de enfermedades, diseñar fármacos que encajen en sitios activos y desarrollar terapias avanzadas.

En este sentido, es importante conocer la estructura del virus vaccinia, responsable de la inmunización lograda contra la viruela. Se llama virión a una partícula viral completa, infecciosa y estructuralmente madura que usualmente se encuentra fuera de una célula huésped. La mayoría de los viriones de los virus que infectan a los humanos tienen tamaños entre 20 y 400 nm, mucho más pequeños que las bacterias, por lo que no son visibles al microscopio óptico y requieren el uso del microscopio electrónico de transmisión (MET) para su visualización.

Sin embargo, una imagen MET convencional es solo una proyección de pequeños objetos tridimensionales, lo que limita la información estructural que se puede obtener de ella. En
muestras biológicas, esta limitación suele ir acompañada de artefactos relacionados con los métodos de preparación empleados (tales como la tinción) y con el daño causado por el haz de electrones. Afortunadamente, en microscopía electrónica actualmente se cuenta con sofisticados instrumentos y métodos experimentales y de análisis que permiten extraer valiosa información estructural de especímenes biológicos.

Criomicroscopía electrónica y tomografía

La fijación de estructuras biológicas sin la adición de sustancias extrañas puede lograrse mediante la congelación ultrarrápida de la muestra en criógenos adecuados, con lo que se logra la vitrificación del agua contenida en ella, preservando así la estructura original. La observación de la muestra en el MET en ese estado congelado evita su calentamiento y destrucción por efecto del haz de electrones. Estas técnicas de preparación y observación a bajas temperaturas constituyen lo que conocemos como criomicroscopía electrónica (crío-MET).

La interacción del haz de electrones con este tipo de muestras es muy débil, lo que conlleva a la obtención de imágenes con baja relación señal-ruido. En los equipos especializados se utilizan fuentes de electrones de emisión por campo, haces de alta
energía (300 keV), bajas dosis, filtros de energía para emplear solo los electrones dispersados elásticamente y detectores de electrones directos, y en algunos casos, placas de fase.

En la crío-tomografía, se utilizan imágenes de la muestra tomadas en una serie de ángulos inclinados ⑧ para generar a partir de éstas una reconstrucción tridimensional (3D) completa de la muestra. Para los estudios en 3D, la adquisición real de las imágenes en el crío-microscopio electrónico es solo una parte del trabajo a realizar, siendo también muy importante el análisis de los datos obtenidos, lo que implica el uso de computadores de alto rendimiento y software especializado.

José Luis Carrascosa y la estructura del virus de la vacuna

Fue uno de estos modernos microscopios el que utilizó el equipo liderado por el investigador español José Luis Carrascosa ⑨ (del Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, España) para determinar la estructura
del virión del virus vaccinia, empleando series de tomogramas ⑩ para la construcción de modelos 3D ⑪. Se usaron muestras del virus vaccinia de las cepas Western Reserve, preparadas por congelación rápida en etano líquido (-180°C).

La reconstrucción tomográfica les permitió analizar los diferentes componentes estructurales del virión, evitando los artefactos de proyección derivados de observaciones microscópicas realizadas anteriormente por diversos investigadores. Una representación
de la superficie revela partículas virales en forma de ladrillo, con bordes ligeramente redondeados y dimensiones comparativamente grandes de 360 × 270 × 250 nm. La capa
externa es compatible con una membrana lipídica (de 5-6 nm de grosor); debajo de ella se observan habitualmente dos cuerpos laterales, formados por un material heterogéneo sin un orden aparente ni características repetitivas. El núcleo interno presenta una cavidad con espirales electrón-densas de presuntos complejos de ADN-proteína, junto con áreas de muy baja densidad. El núcleo está rodeado por dos capas que suman un grosor total de 18-19 nm: la capa interna es compatible con una membrana lipídica, y la capa externa es discontinua, formada por una empalizada periódica construida por la interacción lateral de picos proteicos en forma de T, anclados en la membrana inferior y dispuestos en pequeños cristalitos hexagonales. También fue posible detectar unas pocas estructuras similares a poros que comunican el lado interno del núcleo con la región exterior a la
capa formada por la empalizada de picos en forma de T.

Con esta detallada caracterización tridimensional del virus vaccinia, publicada en 2005 ⑫, se completa un interesante ciclo de poco más de doscientos años, iniciado por la publicación de Jenner en 1798, que reportó por primera vez un método profiláctico de alcance mundial que condujo a la erradicación de una penosa dolencia causante de grandes estragos en la población humana.

En octubre de 2004, pocos meses antes de su publicación, tuvimos el gusto de recibir a Carrascosa en el IDEA, en ocasión de nuestro XI Congreso Venezolano de Microscopía Electrónica, donde nos dictó una interesante conferencia magistral relacionada con crío-MET y la relación estructura-función en virus.